Bem vindo - Quinta-Feira, 30 de Outubro de 2014.
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Instituição sede

IFSC - USP


Metodologia

As principais técnicas experimentais e teóricas que serão empregadas na implantação dos projetos mencionados no item “Pesquisa” estão brevemente descritas abaixo.

1.1  Difração e Espalhamento de Raios-X

Cristalografia de Proteínas

A difração de raios-X para a completa determinação de estruturas biológicas macromoleculares e de seus complexos representa o principal arcabouço experimental do INBEQMeDI. A cristalografia de proteínas será extensivamente empregada na resolução de estruturas de interesse do Instituto, incluindo moléculas alvo e seus complexos com cofatores, substratos (e seus análogos), inibidores, peptídeos, compostos potenciais de partida, fragmentos e fármacos. Ensaios de cristalização empregarão tipicamente protocolos de busca convencionais multi-paramétricos em gotas pendentes, em câmaras termoestáveis, a 4oC ou 18oC, ou utilizando o robô Honeybee 931 da Genomic Solutions Inc. O robô realiza os ensaios de cristalização em “gotas sentadas”, de forma automatizada, em 96 poços. Cada poço permite o uso de três diferentes proteínas ou diferentes concentrações da mesma proteína, acelerando a busca pela formação do cristal. Este é um ponto importante, já que a automatização do processo de busca das condições de cristalização é um ponto chave. Cada busca completa de 1248 condições requer 650-1300mL de proteína purificada e leva aproximadamente 5 horas para ser completado (manualmente essa tarefa leva 6,5 dias). Desde sua recente implantação em nosso laboratório, sete proteínas já foram cristalizadas utilizando tal facility. Ainda, quando for apropriado, medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS) serão utilizadas para auxiliar os procedimentos de busca por condições de cristalização.
A coleta de dados a partir de cristais instantaneamente congelados será realizada na linha de cristalografia de proteínas no LNLS (MX1 e MX2) ou em um sistema doméstico disponível na Instituição sede, empregando uma placa de imagem ou tecnologia de detecção CCD.
Todas as estruturas serão determinadas por técnicas padrão: substituição isomórfica múltipla, MIR (com a produção de derivados de átomos pesados), substituição molecular (quando houver uma estrutura homóloga disponível), dispersão anômala a múltiplos comprimentos de onda (MAD), SAD ou uma combinação deles. Técnicas para melhoramento do mapa de densidade eletrônica e extensão de fase serão empregadas quando apropriado. MAD/SAD serão realizadas na linha MX2 do LNLS e a solicitação de tempo de linha em outros Síncrotrons no exterior será feita onde e quando for necessária.

Cristalografia de Pequenas Moléculas

A determinação da estrutura tridimensional de pequenas moléculas, compostos de interesse a pesquisa, tais como produtos naturais purificados e compostos sintéticos desenhados, será realizada se necessária. Na ausência da estrutura da macromolécula de interesse, esta será obtida por técnicas clássicas de cristalografia de pequenas moléculas, incluindo: 1) cristalização por evaporação ou precipitação controlada com solventes orgânicos; 2) coleta de dados num difratômetro automatizado acoplado a um detector tipo CCD e 3) resolução da estrutura por Métodos Diretos ou Técnicas de Patterson.

Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS)

Sempre que necessário, serão feitas medidas de SAXS em solução, utilizando a linha de SAXS do LNLS, cujas aplicações aos usuários estão disponíveis numa base competitiva. Tais medidas podem ser importantes na determinação dos estados de oligomerização de proteínas em solução, na detecção de mudanças conformacionais relevantes para a atividade biológica e no estudo de intermediários de enovelamento. Serão utilizados parâmetros como o raio de giro e as dimensões máximas da molécula, bem como simulação direta da curva de espalhamento quando um modelo teórico estiver disponível.

1.2  Espectroscopia de Ressonância Nuclear Magnética (RNM)

Nos casos apropriados, técnicas de RNM multidimensional serão usadas para o estudo de pequenas proteínas e/ou peptídeos. Embora atualmente não exista tal facility para RNM de proteínas na Instituição sede, integrantes do instituto tem experiência prévia no uso dessas técnicas, via colaboração com especialistas tanto do LNLS (Campinas), quanto do Centro Nacional de Ressonância Nuclear Magnéticas (UFRJ- Rio de Janeiro). Apesar da difração de raio-X ser encarada pelo futuro Instituto como a principal ferramenta para a biologia estrutural, a técnica de RNM será usada de forma colaborativa quando for considerada mais apropriada. Técnicas de determinação de estrutura ortodoxas e seqüências de pulso (COSY, NOESY etc.) serão empregadas em experimentos multi-dimensionais. Será feito o uso extensivo de enriquecimento isotópico (13C e 15N) em experimentos 2D e 3D, empregando proteínas recombinantes.
Adicionalmente, medidas de RNM 1D serão rotineiramente usadas para a caracterização de moléculas sintéticas pequenas e para a identificação e determinação da estrutura de produtos naturais. Essas medidas já são rotineiramente realizadas no Departamento de Química da UFSCar (DQ/UFSCar), um dos laboratórios associadas deste Instituto (http://www.ifsc.usp.br/~inbeqmedi/labassociados.php). Uma aplicação essencial para o desenho de fármacos serão os estudos em solução do modo de ligação dos ligantes as suas proteínas alvo.

Biologia Molecular e Bioquímica de Proteínas

A grande maioria dos projetos dentro do portfólio inicial do instituto conta com a disponibilidade de proteína recombinante e, assim, com a necessidade de adequar infra-estrutura para a biologia molecular, a purificação de proteínas, controle de qualidade e análises. O uso de proteína recombinante freqüentemente minimiza problemas de pureza e de quantidades limitadas de proteína, associados às amostras nativas, bem como possibilita a manipulação genética. Será feito o uso freqüente de proteínas de fusão, cujos produtos terão tags­ nas regiões N- ou C-terminais, com apropriados sítios de clivagem, a fim de auxiliar na obtenção e purificação de amostras em abundância. Técnicas cromatográficas padrão (troca-iônica, gel filtração, afinidade, fase reversa, etc.) em HPLC ou FPLC e Sistemas ÄKTA também serão empregados.
Além da clonagem, seqüenciamento automatizado e expressão heteróloga em sistemas bacterianos e eucariotos, o instituto empregará técnicas específicas para a produção e manipulação de proteínas de interesse de forma adequada aos estudos estruturais. Quando apropriado, isso poderá incluir a produção de proteínas seleno-metionina substituídas para dispersão anômala a múltiplos comprimentos de onda, bem como amostras enriquecidas com 13C and 15N para NMR multidimensional. Mutações sítio-dirigidas serão usadas como uma sonda estrutural de atividade e função e, potencialmente, como um meio de introduzir sítios de ligação a metais a fim de facilitar a produção de derivados de átomos pesados para experimentos de MIR e MAD.

1.3  Seqüenciamento de Proteínas e Espectrometria de Massa

O Instituto possuirá acesso a um seqüenciador de proteínas por meio das atividades do CBME. Isto permitirá o rápido seqüenciamento de regiões amino-terminais de amostras de proteínas quando necessário, tais como nos casos de identificação de proteínas, informações para o desenho de primers degenerados e clonagem, controle de qualidade, etc.
Técnicas de espectrometria de massa aplicadas a proteínas (tais como MALDI-TOF/TOF ou ESI-TOF/TOF) serão utilizadas quando necessário, seja por colaboração com o LNLS (via CBME) ou utilizando instalações locais, caso estas se tornem disponíveis sob os auspícios do CBME, com vem sendo planejado para os próximos anos. Entre as várias aplicações podemos destacar: 1) Determinação direta da massa de produtos com alta precisa, 2) avaliação de pureza de amostras, 3) detecção de micro-heterogeneidades em amostras de cristalização, 4) verificação de produtos de expressão recombinante, 5) Validação de mutações, 6) Avaliação do conteúdo de carboidratos e outras modificações pós-traducionais, 7) Avaliação da incorporação de isótopos específicos para experimentos de NMR ou de Seleno-metionina para MAD.

1.4  Espectroscopia (Dicroísmo Circular, FTIR, Fluorescência)

Várias técnicas espectroscópicas serão empregadas para dois distintos fins: 1) como um meio de monitorar o enovelamento correto de proteínas recombinantes, particularmente nos casos em que não há um ensaio biológico prontamente disponível, como um ensaio da integridade estrutural e 2) como sondas estruturais. Neste último caso, as sensibilidades específicas das técnicas individuais serão usadas como sondas de estruturas secundárias (CD e FTIR) e terciárias (Fluorescência). Medidas estáticas e dinâmicas (resolvidas no tempo), bem como fluorescência anisotrópica serão usadas como sondas estruturais e dinâmicas de proteínas nativas, mutantes, complexos e intermediários de enovelamento e fluoróforos naturais e artificiais serão usados. CD e FTIR serão usados como um complemento a RMN e difração de raios-X e/ou nos casos onde os últimos foram inaplicáveis.

Ensaios Enzimáticos Automatizados

Para os ensaios de atividade enzimática, determinação de constantes cinéticas e busca de inibidores (usando compostos derivados tanto da biodiversidade brasileira como de fontes comerciais), nós comumente usaremos procedimentos automatizados empregando o sistema robótico BIOMEK3000 da Beckman Coulter. O sistema realiza os ensaios em 96 poços, empregando 8 pipetadores multi-canal, acelerando assim todos os procedimentos. Ensaios cinéticos automatizados para as seguintes enzimas já foram implementados: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), purina nucleosídeo fosforilase, adenina fosforibosiltransferase (APRT) e as enzimas do glicose-6-fosfato desidrogenase. A busca de inibidores teve avanços para a GAPDH, para a qual aproximadamente 10000 compostos foram testados e 5 potenciais inibidores foram identificados.
Faz parte desta proposta estender tal abordagem para outras enzimas alvo. A transferência dos ensaios de manual para automático é direta e nós podemos facilmente automatizar as formas de ensaio em nosso pipeline. Recentemente, nós adquirimos um sistema BIOMEK FX com 96 multi-channel head. A implantação deste segundo BIOMEK nos permitirá um enorme aumento na capacidade de busca, atingindo milhares de buscas por dia. Isto representa um aumento crítico na capacidade necessária para a completa implantação de nosso grupo como um laboratório de referência da WHO para testar fármacos candidatos contra a doença de Chagas.

Modelagem Molecular

Técnicas de modelagem por homologia, tanto as interativas quanto as automatizadas, serão empregadas para a construção de estruturas teóricas para proteínas alvo, como guias iniciais enquanto as determinações experimentais estão em progresso ou em seu lugar, quando considerado apropriado. A modelagem empregará softwares atuais (Modeller_8v2, Orchestra) em PCs e fará extensivo uso de bases de dados disponíveis na Internet. Tais modelos podem ser de uso na interpretação de resultados experimentais pré-existentes, no desenho de futuros experimentos tais como mutação sítio-dirigida ou para substituição molecular quando cristais tornarem-se disponíveis. Técnicas de reconhecimento de enovelamento (threading) serão usadas na tentativa de identificar informações estruturais a “baixa resolução” para proteínas de interesse para as quais não existe estrutura homóloga conhecida. Técnicas de simulação incluindo Dinâmica Molecular serão empregadas quando apropriadas, particularmente para o entendimento de problemas de reconhecimento molecular.
Experimentos de docking de potenciais inibidores e/ou busca exaustiva em bases de dados de compostos comercialmente disponíveis (ZINC, etc.) usarão software existentes, incluindo software próprios (locais) para filtragem dos bancos de dados. Uma variedade de algorítimos de docking (GOLD, DOCK etc) e funções de scoring serão usadas para guiar a descoberta e a otimização de compostos de interesse, bem como para prover uma fundamentação para a atividade de produtos naturais descobertos via programas de screening. Estes dados serão integrados com os resultados de técnicas baseadas em ligantes como as descritas a seguir.

Calorimetria e Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)

O CBME está atualmente equipado com instrumentos para realizar experimentos  tanto de ITC (calorimetria de titulação isotérmica) quanto DSC (calorimetria exploratória diferencial), permitindo a investigação direta das interações proteína-proteína ou proteína-pequenas moléculas. Quando apropriado, tais técnicas serão usadas para o estudo das interações de moléculas pequenas ligantes, identificadas por técnicas alternativas como de interesse.  Adicionalmente, o desenovelamento térmico de proteínas alvo poderá também ser investigado usando DSC.
O CBME também possui um instrumento Biacore X, com o qual já adquiriu considerável experiência em sua utilização nos últimos anos. A técnica de SPR será aplicada a sistemas junto aos quais a determinação acurada de parâmetros cinéticos e termodinâmicos associados aos eventos de ligação são considerados importantes. Esses podem incluir interações proteína-proteína e proteína-molécula pequena. Limitações impostas pelas dificuldades na detecção da ligação dos compostos < 300Da pode requerer o desenvolvimento de ensaios indiretos, nos quais membros da equipe tem adquirido experiência.

Estratégias de Química Medicinal e Triagem de Produtos Naturais

Extratos de espécies nativas brasileiras, principalmente a partir de plantas, fungos e espécies marinhas, serão preparados por métodos de extração tradicional com solventes orgânicos e água e terão sua atividade preliminar determinada nas enzimas alvo desse projeto. O isolamento de compostos bioativos será orientado por ensaios bioquímicos padrões usando técnicas de cromatografia de baixa pressão e de alta eficiência (HPLC). Os compostos serão caracterizados através de análise elementar, espectrometria de massas (MS), espectroscopia de IV, RMN 1H e 13C, ressonância magnética nuclear (RMN). Ensaios de co-cristalização entre ligantes e proteínas serão realizados sempre que possível e as estruturas tridimensionais serão determinadas por cristalografia de raios X. Os compostos bioativos de origem natural serão utilizados como modelos para aplicação de técnicas de modificação molecular com o objetivo de otimizar propriedades como potência e seletividade. A síntese de moléculas de origem natural também poderá ser realizada para determinação do mecanismo de ação de inibidores potentes frente às enzimas alvo e para modificações moleculares guiadas por estratégias de planejamento de fármacos. No presente estudo, foram selecionadas cinco plantas da família Asteraceae, Lychnophora ericoides (“arnica da serra”), Smallanthus sonchifolius (yácon), Tithonia diversofolia (Mexican sunflower), Viguiera arenaria and V. robusta para o isolamento de endófitos. Um total de 90 cepas de fungos e actinobacterias foram isoladas, com várias produzindo extratos e compostos bioativos. Alguns destes, inibiram eficientemente as enzimas GAPDH e APRT de T. cruzi e Leishmania, respectivamente. Dessa forma, esses microorganismos se destacam como fontes importantes de nova diversidade química e moléculas bioativas. Compostos de origem natural serão obtidos também de extratos de plantas e fungos. Os extratos apresentando atividade biológica serão analisados e os princípios ativos isolados. Estes incluem extratos de endófitos e também uma coleção de compostos disponível em nossos laboratórios. No caso de microorganismos, condições de fermentação serão otimizadas para produção em escala apropriada quando atividade biológica significativa for observada. Além disso, reações de biotransformação serão conduzidas em moléculas bioativas promissoras para a obtenção de um melhor a diversidade química em estudo.
Com a finalidade de identificar novos compostos bioativos para as doenças parasitárias alvo deste projeto, o nosso grupo apresenta forte infra-estrutura e característica multidisciplinar, contando com vasta experiência em química medicinal e métodos de planejamento de fármacos, com ênfase nos seguintes aspectos: Emprego de estratégias modernas de química medicinal (baseadas na estrutura do receptor e na estrutura do ligante) para o planejamento de novos compostos potentes e seletivos para as enzimas alvo dos agentes infecciosos; Síntese, purificação e caracterização de novos compostos bioativos; Desenvolvimento de relações entre a estrutura e atividade (SAR) e de relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e 3D); Aplicação de estratégias de triagem virtual baseadas na estrutura do receptor e do ligante; Integração de estratégias interdisciplinares na descoberta de hits e otimização de líderes. Nossos laboratórios possuem ampla infra-estrutura estabelecida para o desenvolvimento de ensaios bioquímicos (ensaios cinéticos) e biológicos in vitro (cultura de parasitas), e também para realização de ensaios in vivo em modelos experimentais da doença alvo e toxidez. Os ensaios de inibição enzimática serão realizados em triplicata em espectrofotômetro Cary 100 Bio UV/VIS equipado com sistema multicélulas automatizado e controle de temperatura. Os ensaios automatizados em larga escala para as enzimas alvo serão conduzidos em um sistema Beckman Biomek 3000, empregando quantidades mínimas de volumes. Os experimentos in vitro e in vivo serão desenvolvidos de acordo com protocolos padrões usando cepas de Trypanosoma cruzi e Leishmania. Em todos os casos, valores de IC50 serão estimados a partir dos dados coletados para pelo menos 7 concentrações de composto. Os valores reportados representarão a média de pelo menos três experimentos individuais. Os valores de IC50 serão estimados de acordo com os dados coletados empregando o programa Sigma-Plot. A dose letal (valores de LD50, em camundongos) para os compostos bioativos mais promissores será determinada usando protocolos padrões. Os procedimentos a serem conduzidos nesse projeto serão aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa de Animais da Universidade Federal de São Carlos, cujos critérios estão de acordo com o International Ethics Committee on Animal Research. Além disso, ferramentas de modelagem molecular de fármacos e predição in silico de propriedades farmacocinéticas (ADME, Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção) estão integradas a nossa plataforma de descoberta de fármacos e estarão disponíveis integralmente neste projeto(www.pkdb.ifsc.usp.br).

INBEQMeDI 2009